Обжиг и проводка одновременно

Самое лучшее в работе нейробиолога - это то, что нейробиология никогда не стоит на месте. Не проходит и недели, чтобы не было нового крупного результата, блестящего технологического прорыва, провоцирующей теоретической идеи. А абсолютная сложность мозгов означает, что количество доступных вопросов практически безгранично. Так что, даже если ваши конкретные области исследования мозга ненадолго замедлили свой бездыханный темп, всегда есть чему поучиться. Всегда новые вопросы. В самом деле, есть целые области мозга млекопитающих, загадки которых почти не исследованы и которые, несомненно, окажутся решающими для нашего понимания. Мои деньги идут на zona incerta, globus pallidus и перегородку. Волнующие времена.

Хуже всего в работе нейробиолога то, что нейробиология никогда не стоит на месте. Не проходит и недели, чтобы не появлялись новые результаты, открытия или теории, которые у вас нет времени читать; это в конечном итоге отправляется на потом, и его никогда не откроют; или быть снятым и не ассимилироваться. А абсолютная сложность мозгов означает, что количество доступных вопросов практически безгранично. Так что, даже если вам повезло, что ваши конкретные области исследования мозга ненадолго замедлили свой бездыханный темп, всегда есть чему поучиться. Всегда новые вопросы. В самом деле, есть целые области мозга млекопитающих, загадки которых почти не исследованы и которые, несомненно, окажутся решающими для нашего понимания. Тревожные времена.

Парадоксально, но этот лучший и худший из всех возможных миров в области интеллектуальных исследований создается бездумным оттоком. Делать все, что можно или можно было бы сделать дальше. Не то, что делать дальше. Итак, высокомерно, я подумал, что упираюсь ногами в поток и пытаюсь отделить должно от могущества. Серия периодических статей, целью которых является ответ на вопрос: что делать системной нейробиологии дальше?

В этой первой части мы начнем с самого определения системной нейробиологии. По сути, это изучение активности нескольких отдельных нейронов и отправляемых ими сообщений. Все, что мы видим, делаем или думаем в данный момент, происходит через нейроны, посылающие друг другу импульсы. Таким образом, очевидным приоритетом для системной нейробиологии является создание наилучших записей выходных сигналов большинства нейронов с использованием как можно большего количества метаданных об этих нейронах - где они находятся, сколько их, какого они типа - насколько это возможно.

У нас есть два основных способа записи выходного сигнала отдельных нейронов: вставка электродов для записи спайков или изображения потоков кальция в телах нейронов в качестве заместителя спайков. У обоих есть уникальные сильные стороны, оба постоянно развиваются в пылу технологий (и денег), но у обоих есть проблемы, которые решает другой. Итак, наше первое «следует»: мы должны найти метод записи, сочетающий в себе сильные стороны обоих. Хорошая новость в том, что мы уже знаем ответ. Ответ - визуализация напряжения.

И если мы решим эту проблему, визуализация напряжения станет огромным бонусом, чего нам не купят ни электроды, ни кальциевая визуализация: коннектомика в реальном времени.

Не поймите меня неправильно, текущий уровень технологий звукозаписи просто потрясающий.

Электроды набирают силу. Как с любовью задокументировано Яном Стивенсоном, за последние несколько десятилетий мы наблюдали экспоненциальный рост числа нейронов, которые мы можем регистрировать одновременно с электродами. Непрерывное ускорение, которое в настоящее время удваивается примерно каждые шесть лет. Ствол du jour - это зонд NeuroPixels, чудо инженерной мысли, с ошеломляюще высоким выходом импульсов от нескольких сотен отдельных нейронов через стержень такой длины, что он может записывать данные от коры головного мозга до глубин мозга грызунов. в то же время.

Но. Но как ни крути вал, вал все равно слепой. Мы не знаем, с каких нейронов мы ведем запись. Мы не видим ничего, кроме шипов. А запись вслепую предвзята: по определению мы не можем видеть нейроны, которые посылают мало или не посылают импульсов на устройстве, которое регистрирует только импульсы.

Визуализация кальция решает проблему слепоты. Здесь мы вставляем флуоресцентные молекулы в тела многих нейронов, молекулы, связывающие кальций. Кальций в теле нейрона увеличивается с каждым спайком. Таким образом, логика визуализации кальция в системной нейробиологии проста: повышенный уровень кальция означает, что повышенная флуоресценция означает больше всплесков. Нам просто нужно направить видеокамеру или аналог на нейроны, чтобы записать изменения флуоресценции, и у нас есть способ одновременной записи выходных сигналов от многих десятков до десятков тысяч нейронов. Даже лучше, чем это огромное количество нейронов, мы можем видеть, что мы записываем, какие типы нейронов активны или неактивны и где они находятся.

Но. Но изменения в кальции медленны по сравнению с временными рамками, в течение которых возникают спайки. Таким образом, быстрые последовательности всплесков в лучшем случае могут быть скрыты, а в худшем - полностью невидимы для визуализации кальция. И связь между спайками и кальцием нелинейна: нет одинакового увеличения кальция для каждого скачка в последовательности. Провести линию от изменений флюоресценции к импульсному выходному сигналу нейрона совсем не просто.

Мы хотим и того, и другого: мы хотим визуализировать шипы. Затем мы можем объединить знание спайков от каждого нейрона (например, электродов) со знанием того, что и где находится каждый нейрон (например, визуализация кальция).

И у нас это было десятилетиями. Так в чем же загвоздка?

Когда я говорю десятилетия, я имею в виду десятилетия. Первое крупное сообщение об использовании изображения напряжения для отдельного нейрона было сделано в 1973 году. [Зальцберг, Б. М., Х. В. Давила и Л. Б. Коэн. 1973. Оптическая регистрация импульсов в отдельных нейронах центральной нервной системы беспозвоночных. Nature 246: 508–509.] Насколько я понимаю, есть несколько серьезных препятствий.

Основой визуализации напряжения были (и есть) красители, молекулы, которые связываются с мембраной нейрона и флуоресцируют пропорционально напряжению на этой мембране. Как и у всех красителей, у них есть проблемы (как и у красителей, используемых для визуализации кальция). Нам не хватает контроля над тем, какие нейроны поглощают краситель, а красители могут неравномерно поглощаться нейронами одного и того же участка ткани.

Самая большая проблема заключается в том, что флуоресценция чувствительных к напряжению молекул изменяется совсем незначительно, сродни обнаружению сердцебиения комара в аэродинамической трубе. У них ужасное соотношение сигнал / шум. Количество фотонов, испускаемых молекулами внутри участка мембраны, практически не отличается от фонового шума; По одной оценке объединенный оптический сигнал от одного нейрона имеет максимальное отклонение от 0,0001 до 0,003 процента по сравнению с фоном. Это также означает, что изменение излучения фотонов в теле нейрона практически не отличается от окружающей ткани. До сих пор решение проблемы отношения сигнал-шум означало сбор большого количества фотонов, чтобы отличить сигнал от шума.

Один из способов получить много фотонов - посмотреть на действительно большие нейроны. Визуализация напряжения прекрасно работает у беспозвоночных, у которых есть гигантские нейроны. Таким образом, визуализация напряжения уже решает фундаментальные вопросы системной нейробиологии. Например, в середине 1990-х в основополагающих статьях Ву и др. Было установлено существование многофункциональных цепей - единой популяции нейронов, динамика которой лежит в основе двух различных моделей поведения. Десять лет спустя Бриггманн и Кристан показали, что низкоразмерная активность популяции нейронов кодирует решение ползать или плавать на пиявке. Еще десять лет спустя (середина 2010-х) и лаборатория моего соавтора Билла Фроста регистрирует каждый всплеск от 200 одновременных отображаемых напряжений нейронов в морских слизняках. Мы повеселились с этими данными, например, выяснили, на каком именно аттракторе сидит низкоразмерная активность. Кто знает, что могут принести следующие десять лет?

Еще один способ получить много фотонов - посмотреть на большие участки мозга, чем на отдельные нейроны. Как целые участки коры сразу, где каждая отдельная последовательность флуоресценции представляет собой сумму сотен или тысяч нейронов. В середине 90-х Ариэли, Гринвальд и его коллеги объединили эту визуализацию коры головного мозга в широком поле с электродными записями одного нейрона в этом поле, чтобы получить некоторое представление о том, что происходило, когда этот нейрон сработал. В процессе они показали, что как спонтанная, так и вызванная стимулами активность в зрительной коре поразительно похожа, что стало краеугольным камнем для современных теорий предсказательной обработки того, что такое корковая активность.

Это здорово. Но мы хотим зарегистрировать множество отдельных нейронов у млекопитающих. Кроме того, мы уже репетировали, что у красителей есть проблемы. Таким образом, приоритетом для визуализации напряжения является решение проблемы отношения сигнал-шум путем поиска молекул, которые излучают гораздо более высокую долю фотонов. И чтобы решить эту проблему, используя генетически закодированные датчики, для превосходного восприятия нейронов в определенных популяциях, и это позволит делать умные манипуляции, я недостаточно умен, чтобы думать о них, но другие люди умеют. Приоритетом является визуализация спайков в нескольких нейронах с помощью генетически закодированных датчиков напряжения.

Внезапным всплеском активности эти вопросы решаются.

За последние несколько лет появилось множество новых генетически закодированных датчиков напряжения, каждый из которых решает некоторые проблемы. Например, увеличить время стабилизации сенсора, прежде чем он обесцветится и станет бесполезным. Лучшее соотношение сигнал / шум. Или получить фотоны, испускаемые в другой части спектра, чтобы изображение флуоресценции датчика могло быть объединено с источниками света, необходимыми для оптогенетики. А лаборатория Марка Шнитцера недавно представила подход, позволяющий делать оптоволоконные записи датчиков напряжения, позволяя создавать глубокие изображения мозга совместного напряжения группы нейронов.

И теперь у нас есть крупный прорыв, проблеск полного потенциала, который достигается одновременно несколькими группами, как это часто бывает. В статье Nature в этом месяце от группы Адама Коэна, препринте под руководством Сюэ Хана и Эда Бойдена и препринте колоссальной команды с фермы Джанелия мы Теперь у нас есть доказательство принципа того, что мы можем делать все, что захотим: одновременно отображать спайки нескольких генетически помеченных нейронов в глубоких тканях у ведущих поведение животных. Конечно, по сравнению с масштабом передовых электродных записей или изображений кальция, цифры здесь крошечные, всего лишь горстка нейронов (хотя одна запись из нескольких десятков дразняще демонстрируется в препринте Janelia Farm). Но главный прорыв - это чувствительность самих датчиков.

Все команды заявили о поразительно высоком соотношении сигнал / шум. Достаточно высокий, чтобы мы могли видеть не только всплески, большие скачки напряжения, но и само мембранное напряжение, причем в нескольких нейронах одновременно. И это бонусный приз.

Визуализация только спайков - это действительно круто: сочетание сильных сторон электродов с визуализацией кальция. Это достаточная причина для того, чтобы в первую очередь сделать визуализацию напряжения. Но моя настоящая цель здесь состоит в том, что мы хотим изобразить само мембранное напряжение. Потому что с этим у нас есть наилучшие данные для определения связей между нейронами, с которых мы записываем.

Выявление связей между нейронами по их спайкам уже несколько десятилетий было делом неврологии. Основная идея состоит в том, что если мы записываем нейроны {1,2,3,…, N} и нейрон 1 подключен к нейрону 2, то импульсы от нейрона 1 должны оказывать заметное влияние на то, когда нейрон 2 посылает импульс. Проблема в том, что независимо от того, насколько сложны математические расчеты, проблема ужасно недооценена. Шипы действительно редкие, и сами по себе они никогда не вызывают других всплесков. В конце концов, в коре головного мозга всплеск возникает, когда нейрон интегрирует от десятков до сотен входных сигналов, в результате чего его мембранное напряжение достигает критической точки (в первом приближении). И это без учета бесчисленных помех других входов в нейроны.

Но спайки вызывают небольшие изменения в напряжении мембраны целевого нейрона, постсинаптических потенциалах. Спайк от нейрона 1, вероятно, вызовет мерцание напряжения в нейроне 2. Конечно, это не соотношение 1: 1; но совместное появление всплесков и мерцаний будет гораздо более плотным, чем одни всплески. И они поставляются с критически важной информацией о времени, поскольку, хотя всплеск в нейроне 2 может произойти через несколько миллисекунд или несколько сотен миллисекунд после всплеска в нейроне 1, колебания напряжения в нейроне 2 должны происходить каждый раз примерно с одинаковой задержкой. Таким образом, возможность записывать колебания напряжения, вызванные импульсами, приходящими на каждый нейрон, даст нам много информации, которую мы можем использовать для определения связей между нейронами. Дает нам предсказуемые, привязанные ко времени причины и следствия в парах связанных нейронов. Точно такую ​​же информацию мы получаем из деликатного, сложного процесса наложения электродов на два, три или четыре нейрона, который мы уже используем в качестве золотого стандарта для определения функциональных связей между нейронами, но увеличенный на порядок величина.

И это бонус: отображение напряжения с высоким отношением сигнал / шум дает нам не только всплески, но и мерцания напряжения, вызванные всплесками. Визуализация напряжения может дать нам не только пожары, но и провода.

Вот к чему мы должны стремиться: вольт-амперная визуализация мембранных потенциалов тысяч (или более) нейронов одновременно. Как? Благодаря сочетанию всех вышеперечисленных последних достижений в датчиках напряжения с методами записи, бесконечно оптимизируемыми исследованиями изображений кальция.

Тогда представьте себе это. Однажды мы сможем регистрировать напряжение тысяч нейронов одновременно у хорошо себя ведающего животного. Эти данные дадут нам срабатывание тысяч нейронов коры головного мозга, гиппокампа, полосатого тела или миндалины. Нейроны известного местоположения, типа и числа. И это также даст нам их мембранные напряжения. С этими данными мы могли реконструировать проводку между нейронами in situ, выполнить «живую коннектомику». Схема подключения не только одного примера схемы от одного животного, кропотливо построенная в течение многих лет глубокой и упорной работы под микроскопом. Но прямо сейчас проводка того, что вы записываете. В более простых схемах и в более простых животных это могло бы дать нам полную схему проводки. Живой коннектом. Кажется, стоит попробовать.

Хотите еще? Следуйте за нами в The Spike

Twitter: @markdhumphries